層析工藝開發(fā)中緩沖液的選擇策略

2022-11-03 11:15:34

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概述

建立蛋白質(zhì)層析純化工藝時(shí)，最重要的是需要考慮純化得到的蛋白質(zhì)應(yīng)能滿足其后續(xù)應(yīng)用要求。蛋白質(zhì)的數(shù)量及純度都必須滿足實(shí)驗(yàn)分析要求。而且，因?yàn)楹罄m(xù)研究需要的是保持良好折疊結(jié)構(gòu)的活性蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì)行為的相關(guān)信息也需要考慮。在純化及后續(xù)的保存過程中，很多處理方法都會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的性質(zhì)產(chǎn)生影響，如蛋白質(zhì)的去折疊、聚集、降解和失活等。制定詳細(xì)計(jì)劃，在最短時(shí)間內(nèi)完成蛋白質(zhì)純化，并在最穩(wěn)定的條件下進(jìn)行保存才算是成功地完成了其整個(gè)純化過程。

當(dāng)我們純化蛋白時(shí)，最重要的就是要保持蛋白在純化過程中不能去折疊、聚集、降解和失活，或者是盡量降低純化過程對(duì)蛋白活性帶來的損失。這就要求蛋白在整個(gè)純化過程中要始終保持可溶性和活性。

在層析工藝緩沖液選擇時(shí)應(yīng)考慮以下幾個(gè)因素：pH值、緩沖體系、添加劑。其中每一個(gè)因素都要根據(jù)你的目的蛋白進(jìn)行優(yōu)化，并以目的蛋白的活性作為優(yōu)化的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。

pH的選擇

在蛋白質(zhì)層析工藝中，首先我們要考慮蛋白質(zhì)的pH穩(wěn)定性和可溶性，一般蛋白質(zhì)在其pI附近的pH值溶液中容易沉淀。在層析工藝開發(fā)前，我們先要驗(yàn)證目標(biāo)蛋白的pH穩(wěn)定性。每一種層析介質(zhì)都有它的工作pH范圍，我們在開發(fā)層析工藝時(shí)，要了解所選擇的層析介質(zhì)的工作pH范圍。所以我們設(shè)計(jì)層析工藝時(shí)，同時(shí)要考慮蛋白質(zhì)的pH穩(wěn)定性范圍及層析介質(zhì)的工作pH范圍。

緩沖液體系的選擇

每一步純化過程中，蛋白質(zhì)的溶液環(huán)境對(duì)其穩(wěn)定性和活性的保持都非常關(guān)鍵。蛋白質(zhì)應(yīng)該保存在一個(gè)良好的緩沖液環(huán)境中，要避免突然的pH值變化，以其防止對(duì)蛋白質(zhì)折疊狀態(tài)、溶解性和活性造成不可逆的影響。

圖 1. 含Tris堿及其酸式物的Tris緩沖液溶液。Tris 25°C的pKa值是8.06，表示當(dāng)pH=8.06，50%的Tris是質(zhì)子化（酸式結(jié)構(gòu)），50%是去質(zhì)子化（堿式結(jié)構(gòu)）。

緩沖液是一種含有共軛酸/堿對(duì)的水溶液。緩沖液的pH值范圍根據(jù)其pKa值決定。該pKa值定義為50%的分子為酸式結(jié)構(gòu)，50%為堿式結(jié)構(gòu)時(shí)的pH值（圖1）。關(guān)于緩沖液的一個(gè)常規(guī)原則是，其pH值應(yīng)保證在pKa值左右1個(gè)pH值單位范圍內(nèi)，從而保證其具有良好的緩沖能力。如此可以保證同時(shí)有足夠的以酸式結(jié)構(gòu)和堿式結(jié)構(gòu)存在的分子在加入 H+ 或者 OH- 時(shí)可以將它們中和。這樣，緩沖液就可以防止pH變化導(dǎo)致的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性改變。

一種好的緩沖液必須具有以下特征 :

?水溶性

?化學(xué)穩(wěn)定性

?在所需pH范圍內(nèi)良好的緩沖能力

?與分析和實(shí)驗(yàn)應(yīng)用條件具有良好的兼容性

?與其他溶質(zhì)具有良好的兼容性

很多物質(zhì)都可以用于生物緩沖液。最常使用的緩沖液成分通常具有接近中性的pKa值，可在生理pH值范圍左右使用。表1列出了4種最常用的生物緩沖液、各自的pH值應(yīng)用范圍及各自可能對(duì)蛋白質(zhì)純化過程產(chǎn)生影響的優(yōu)缺點(diǎn)。為保證足夠的緩沖能力，這些緩沖液的濃度通常為25mM。

表一：蛋白質(zhì)純化中最常用的生物緩沖液。緩沖液在一定pH值范圍內(nèi)可保持它們的緩沖能力，部分緩沖液成分會(huì)對(duì)某些層析過程或者分析實(shí)驗(yàn)造成影響。

添加劑的選擇

除了一個(gè)合適的緩沖液體系，蛋白質(zhì)純化過程中——從溶菌到保存——所使用的溶液通常還含有很多其他對(duì)蛋白質(zhì)純度、穩(wěn)定性和活性方面均具有一定作用的成分。溶菌緩沖液和純化工藝的前期步驟中常常會(huì)添加蛋白酶抑制劑以防止目標(biāo)蛋白質(zhì)被內(nèi)源性蛋白酶酶解。而純化工藝的后期一般不用再添加這些蛋白酶抑制劑，因?yàn)榇藭r(shí)幾乎所有的蛋白酶都已經(jīng)從目標(biāo)蛋白質(zhì)分離出去。蛋白質(zhì)的保存緩沖液中通常要添加金屬螯合劑，如EDTA或EGTA。這些金屬螯合劑與 Mg2+結(jié)合以防止目標(biāo)蛋白質(zhì)被所含的金屬蛋白酶分解。還有一些其他的添加劑，主要是用來保護(hù)蛋白質(zhì)不被破壞和增強(qiáng)其溶解性。