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絲氨酸蛋白酶下游工藝解決方案

2023-12-11 13:10:15
絲氨酸蛋白酶


絲氨酸蛋白酶是一個蛋白酶家族,它們的作用是斷裂大分子蛋白質中的肽鍵,使之成為小分子蛋白質。在哺乳類動物里面,絲氨酸蛋白酶扮演著很重要的角色,特別是在消化,凝血補體系統(tǒng)方面。其激活是通過活性中心一組氨基酸殘基變化實現(xiàn)的,它們之中一定有一個是絲氨酸。


絲氨酸蛋白酶的特點是具有獨特的結構,由兩個在催化活性位點會聚的β-桶結構域組成。這些酶可以根據(jù)它們的底物特異性進一步分類為胰蛋白酶樣、胰凝乳蛋白酶樣或彈性蛋白酶樣。


胰蛋白酶樣

胰蛋白酶樣蛋白酶在帶正電荷的氨基酸(賴氨酸或精氨酸)之后切割肽鍵。這種特異性是由位于酶S1口袋底部的殘基驅動的(通常是帶負電荷的天冬氨酸或谷氨酸)。


胰凝乳蛋白酶樣

胰凝乳蛋白酶樣酶的S1口袋比胰蛋白酶樣蛋白酶更疏水。這導致對中到大尺寸疏水殘基的特異性,例如酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。


類凝血酶

這些包括凝血酶、組織激活型纖溶酶原和纖溶酶。已發(fā)現(xiàn)它們在凝血和消化以及神經(jīng)退行性疾病(如阿爾茨海默氏癥和帕金森氏誘發(fā)的癡呆癥)的病理生理學中發(fā)揮作用。


類彈性蛋白酶

彈性蛋白酶樣蛋白酶的S1裂縫比胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶小得多。因此,殘基如丙氨酸、甘氨酸和纈氨酸往往是優(yōu)選的。


枯草桿菌蛋白酶

枯草桿菌蛋白酶是原核生物中的一種絲氨酸蛋白酶。枯草桿菌蛋白酶在進化上與胰凝乳蛋白酶家族無關,但具有相同的催化機制,利用催化三聯(lián)體來產(chǎn)生親核絲氨酸。這是用來說明趨同進化的經(jīng)典例子,因為同一機制在進化過程中獨立進化了兩次。



苯甲瞇


苯甲脒類物質是絲氨酸蛋白酶的廣譜抑制劑,所以將這類物質偶聯(lián)到瓊脂糖微球上,可從各種來源的樣品中一步純化胰蛋白酶、凝血酶、尿激酶、激肽釋放酶、前激肽釋放酶等絲氨酸蛋白酶。


苯甲瞇高流速瓊脂糖微球親和介質


苯甲瞇高流速瓊脂糖微球《Benzamidine Seplife 4FF》是藍曉科技自主研發(fā)的一種特異性結合絲氨酸蛋白酶的親和層析介質,具有良好的化學穩(wěn)定性和生物相容性。它是將苯甲脒類物質偶聯(lián)到高流速瓊脂糖凝膠過濾層析介質上,可以從各種來源的樣品中進一步純化胰蛋白酶,凝血酶,尿激酶,激肽釋放酶,前激肽釋放酶等絲氨酸蛋白酶。Benzamidine Seplife 4FF層析介質運用新的活化方法,具有流速高,非特異吸附少,分離效果好的特點,是純化絲氨酸蛋白酶類最合適的層析介質。


Benzamidine Seplife 4FF推薦使用條件

?平衡緩沖液:0.05mol/L Tris-HCl 0.5mol/L NaCl pH7.4

洗脫方式一般有3種:

?競爭洗脫:在緩沖液中加入20mmol/L的p-氨基苯甲脒。

?pH洗脫:如0.05mol/L甘氨酸-HCl,pH3.0或者0.01mol/L HCl 0.5mol/L NaCl,pH2.0。

?變性洗脫:如在洗脫緩沖液中加入8M尿素或6M鹽酸胍等。

?注意:如果使用低pH洗脫條件,在收集的洗脫液中需要加入1M Tris-HCl, pH=9溶液,防止由于低pH導致的洗脫蛋白變性,一般每毫升洗脫液加入60-200ul。

?保存:保存條件為20%乙醇/乙酸緩沖液(乙酸緩沖液pH=4),儲存溫度2~8℃。

更多信息請聯(lián)系蘇州藍曉生物:0512-65160522


應用案例:胰蛋白酶親和層析純化

層析條件

層析柱:26mm*200mm ;裝柱高度:100mm;

裝填填料:Benzamidine Seplife 4FF

流速:5 ml/min;

緩沖液A:Tris-HCl + NaCl;

緩沖液B:Tris-HCl;

樣品說明:胰糜蛋白酶粗品

圖1:Benzamidine Seplife 4FF純化胰蛋白酶色譜圖


親和層析結果分析:應用案例:胰蛋白酶親和層析純化

分別對原液、流穿液、洗脫液中蛋白濃度和胰糜蛋白酶的效價進行測定。蛋白濃度通過紫外吸收法,效價測定根據(jù)中國藥典2015年版胰糜蛋白酶的效價測定方法

項目

糜效u/mg

胰效價u/mg

上樣液

1109

990.81

流穿液

1447.46

0

洗脫液

0

2660.38

中國藥典2015年版規(guī)定糜蛋白酶的效價不小于1000單位/mg;胰蛋白酶效價不得少于2500單位/mg。由此可以看出藍曉科技開發(fā)生產(chǎn)的Benzamidine Seplife 4FF親和層析介質可以用來生產(chǎn)滿足藥典要求的胰蛋白酶和糜蛋白酶。

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