Vero細(xì)胞

Vero胞(非洲綠猴腎細(xì)胞)是日本學(xué)者Yasumura和Kawakita兩人在1962年正式從非洲綠猴腎臟分離的，初次用于生產(chǎn)人用生物制品的異倍體貼附依賴性細(xì)胞，并建立了細(xì)胞系和不同代次的細(xì)胞庫(kù)。在此之前，對(duì)生物制品的研究和生產(chǎn)只允許用原代細(xì)胞或二倍體細(xì)胞。

近年來隨著生物技術(shù)的發(fā)展，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已從簡(jiǎn)單的試驗(yàn)研究拓展到了生物學(xué)研究和商業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域。生物制品如病毒性疫苗、醫(yī)學(xué)治療性抗體的研究與生產(chǎn)都用到了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。

Vero細(xì)胞在病毒類生物制品生產(chǎn)上的應(yīng)用

?新冠病毒滅活疫苗

?狂犬病毒滅活疫苗

?輪狀病毒疫苗

?流行性乙型腦炎病毒疫苗

?腸道病毒 71 型疫苗

?脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗(IPV)

?口服脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗(OPV)

1987年，WHO才正式批準(zhǔn)傳代細(xì)胞系作為生物制品生產(chǎn)的基質(zhì)。Vero細(xì)胞被批準(zhǔn)用于人用疫苗的生產(chǎn)后，開始生產(chǎn)的人用疫苗是Barrett等生產(chǎn)的脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗(IPV)，之后Vero細(xì)胞用于狂犬病毒疫苗和口服脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗(OPV)等多種人用疫苗生產(chǎn)。Vero細(xì)胞在病毒性疫苗生產(chǎn)的應(yīng)用已有30年之久，尤其是狂犬病毒疫苗和脊髓灰質(zhì)炎疫苗。

Vero細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)

?容易建立細(xì)胞庫(kù)和保存，可連續(xù)傳代，生長(zhǎng)速度快；

?Vero 細(xì)胞遺傳性狀穩(wěn)定，惡性化概率小，無外源性污染，具有良好的生物安全特性；

?Vero 細(xì)胞對(duì)多種病毒敏感，生產(chǎn)的病毒滴度高；

?Vero 細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)條件要求不高，在微載體表面能良好的貼附生長(zhǎng)，易在生物反應(yīng)器放大培養(yǎng)。

大規(guī)模反應(yīng)器微載體培養(yǎng)Vero細(xì)胞

馴化Vero細(xì)胞適應(yīng)在用于大規(guī)模生產(chǎn)的無血清培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)。帶有詳細(xì)傳代記錄的Vero細(xì)胞凍存管被復(fù)蘇；并傳代到T形瓶和滾瓶中，生產(chǎn)出足夠數(shù)量的細(xì)胞以接種Seplife LX-MC-dex1微載體生物反應(yīng)器。細(xì)胞匯合后， 細(xì)胞按照大約1:7的比例傳代到后面的生物反 應(yīng)器。最終的細(xì)胞密度在2-3×106/ml。

微載體培養(yǎng)是目前公認(rèn)的最有發(fā)展前途的一種動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，其兼具懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，放大容易。將對(duì)細(xì)胞無害的微載體顆粒加入培養(yǎng)容器的培養(yǎng)液中，作為載體，使細(xì)胞在微載體表面附著生長(zhǎng)，同時(shí)通過持續(xù)攪動(dòng)使微載體始終保持懸浮狀態(tài)。貼壁依賴性細(xì)胞在微載體表面上的增殖，要經(jīng)歷黏附貼壁、生長(zhǎng)和擴(kuò)增三個(gè)階段。細(xì)胞只有貼附在固體基質(zhì)表面才能增殖，因此細(xì)胞在微載體表面的貼附是進(jìn)一步鋪展和生長(zhǎng)的關(guān)鍵。細(xì)胞主要通過靜電引力和范德華力與微載體黏附，這取決于細(xì)胞與微載體的接觸概率和相融性。

圖片來源：科興中維生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)的vero細(xì)胞顯微鏡下觀察的照片_百度圖片搜索 (baidu.com)

藍(lán)曉科技的微載體廣泛應(yīng)用在疫苗、單抗、基因治療病毒載體等生物制品的大規(guī)模生產(chǎn)中，藍(lán)曉科技自主研發(fā)的Seplife LX-MC-dex1細(xì)胞培養(yǎng)微載體在Vero細(xì)胞、CHO細(xì)胞、293T細(xì)胞及MDCK細(xì)胞等已廣泛用于生物制品的大規(guī)模生產(chǎn)中，細(xì)胞可貼附微球 2D 表面生長(zhǎng)，1g的Seplife LX-MC-dex1微載體提供 4400 cm2的表面積給細(xì)胞貼附。

Seplife LX-MC-dex1技術(shù)參數(shù)

細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

Vero細(xì)胞在兩家不同批次微載體的培養(yǎng)基中，24h至96h細(xì)胞生長(zhǎng)曲線如圖1所示。

圖1：藍(lán)曉科技細(xì)胞培養(yǎng)微載體和進(jìn)口微載體用于Vero細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線

細(xì)胞生長(zhǎng)情況觀察

圖2：藍(lán)曉科技細(xì)胞培養(yǎng)微載體用于Vero細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)情況觀察

Seplife LX-MC-dex1微載體的應(yīng)用領(lǐng)域非常廣泛，基于微載體生產(chǎn)的疫苗除了新冠以外，還包括脊髓灰質(zhì)炎、風(fēng)疹、狂犬病、流感、日本腦炎（乙型腦炎）、呼吸道合胞病毒（RSV）和口蹄疫（FMD）疫苗等。與其他細(xì)胞培養(yǎng)工藝相比，微載體培養(yǎng)工藝可以提高產(chǎn)量，降低成本，并減少污染。

Seplife LX-MC-dex1微載體使用方法

1.微載體預(yù)處理

首先，干燥的微載體在無 Ca2+ 和 Mg2+ 的磷酸緩沖液（PBS pH=7.4，每克微載體加50-100ml）中在室溫下浸泡膨脹至少 3 小時(shí)。然后，棄去上清液，用新配制的無 Ca2+ 、Mg2+ 的PBS（pH=7.4，每克微載體加30-50ml）洗滌微載體數(shù)分鐘。接著，棄去 PBS，換上新的無 Ca2+ 、Mg2+ 的 PBS（pH=7.4，每克微載體加 30-50ml）。之后，微載體溶液用高壓滅菌法滅菌（115℃，15min，15psi）。微載體Seplife LX-MC-dex1 非常穩(wěn)定，可以反復(fù)（至少5次）長(zhǎng)時(shí)間 （130°C，12h，27psi）進(jìn)行高壓滅菌而不影響其性能。滅菌結(jié)束后使用前，加入培養(yǎng)基潤(rùn)洗置換（20-50ml/g），之后加入 10%血清或無血清培養(yǎng)基放置過夜。

2.微載體培養(yǎng) 

準(zhǔn)備好消化好的細(xì)胞，連同之前準(zhǔn)備好的微載體一起加入方瓶或反應(yīng)器中（微載體加量 1-5g/L），在一定條件下開始培養(yǎng)，4 小時(shí)后觀察細(xì)胞貼附情況。如果細(xì)胞貼附良好，繼續(xù)跟蹤培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

3 微載體培養(yǎng)操作要點(diǎn) 

（1）培養(yǎng)初期：

保證培養(yǎng)基與微球體處于穩(wěn)定的 pH 與溫度水平，接種細(xì)胞（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期， 而非穩(wěn)定期）至終體積 1/3 的培養(yǎng)液中，以增加細(xì)胞與微載體接觸的機(jī)會(huì)。常使用 2-3g/L 的微載體含量，更高的微載體濃度需要控制環(huán)境或經(jīng)常換液。由于動(dòng)物細(xì)胞無細(xì)胞壁，對(duì)剪切力敏感，因而無法靠提高攪拌轉(zhuǎn)速來增加接觸概率。通常的操作方式是：在貼壁期采用低攪拌轉(zhuǎn)速，時(shí)攪時(shí)停；數(shù)小時(shí)后，待細(xì)胞附著于微載體表面時(shí)， 維持設(shè)定的低轉(zhuǎn)速，進(jìn)入培養(yǎng)階段。微載體培養(yǎng)的攪拌非常慢，最大速度 75r/min。 

（2）貼壁階段（3-8d）后，緩慢加入培養(yǎng)液至工作體積，并且增加攪拌速度保證完全均質(zhì) 混合。 

（3）培養(yǎng)維持期：進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)（胞核計(jì)數(shù)）、葡萄糖測(cè)定及細(xì)胞形態(tài)鏡檢。隨著細(xì)胞增 殖，微球變得越來越重，需增加攪拌速率。經(jīng)過 3d 左右，培養(yǎng)液開始呈酸性，需換液。具體方 法：停止攪拌，讓微珠沉淀 5min，棄掉適宜體積的培養(yǎng)液，緩慢加入新鮮培養(yǎng)液（37℃），重 新開始攪拌。

（4）收獲細(xì)胞：首先，排干培養(yǎng)液，至少用緩沖液漂洗 1 遍；然后，加入相應(yīng)的酶，快速 攪拌（75-125r/min）20-30min；最后，解離收集細(xì)胞及其產(chǎn)品。 

（5）微載體培養(yǎng)的放大：可以通過增加微載體的含量或培養(yǎng)體積進(jìn)行放大。使用異倍體或 原代細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)疫苗、干擾素，已被放大至 4000L 以上。

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